動物細(xì)胞的特點(diǎn)及生長特性:
動物細(xì)胞雖可像微生物細(xì)胞一樣, 在人工控制條件的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng), 但其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和培養(yǎng)特性與微生物細(xì)胞相比, 有顯著差別 :①動物細(xì)胞比微生物細(xì)胞大得多, 無細(xì)胞壁, 機(jī)械強(qiáng)度低, 對剪切力敏感, 適應(yīng)環(huán)境能力差; ②倍增時(shí)間長, 生長緩慢, 易受微生物污染, 培養(yǎng)時(shí)須用抗生素; ③培養(yǎng)過程需氧量少（氧傳質(zhì)系數(shù)kLa 大于10 h - 1即可滿足每毫升107 個細(xì)胞的生長） ; ④培養(yǎng)過程中細(xì)胞相互粘連以集群形式存在; ⑤原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50 代即退化死亡; ⑥代謝產(chǎn)物具有生物活性, 生產(chǎn)成.本高, 但附加值也高。
一. 固定化動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)
1. 固定化培養(yǎng)方法
在動物細(xì)胞培養(yǎng)中, 培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活細(xì)胞培養(yǎng)中, 培養(yǎng)細(xì)胞的目的不僅僅要求催化活力, 更重要的是利用細(xì)胞來合成和分泌蛋白, 因此如何保持細(xì)胞的活性顯得尤為重要。由于動物細(xì)胞的極度敏感性, 上述這些固定化方法會對動物細(xì)胞產(chǎn)生毒性, 另外多糖（如卡拉膠等） 由于具有很高的離子強(qiáng)度也會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害。故在動物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法, 如吸附、包埋、中空纖維或膠囊化。
1. 1 吸附
1. 1. 1 多孔陶瓷
美國某公司開發(fā)了一種*自動化的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)的核心是陶質(zhì)矩形蜂窩狀生物反應(yīng)器。反應(yīng)器構(gòu)型是一圓筒內(nèi)裝置有許多陶質(zhì)矩形通道的蜂窩狀圓柱體，可提供4. 25 m2 的生長表面積。既可用于培養(yǎng)懸浮生長的細(xì)胞,又可用于培養(yǎng)貼壁依賴性細(xì)胞。該系統(tǒng)可以連續(xù)化生產(chǎn)蛋白質(zhì)。由于產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)基中, 給分離純化帶來方便。而且細(xì)胞不用從培養(yǎng)基中分離, 所以不必考慮梯度問題; 當(dāng)培養(yǎng)基高速循環(huán)時(shí), 可以保持相對恒定的營養(yǎng)物和氧濃度。增加套數(shù)即可實(shí)現(xiàn)放大.
1. 1. 2 微載體
微載體細(xì)胞培養(yǎng)法是一種用于培養(yǎng)錨地依賴性細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。這種培養(yǎng)技術(shù)是在生物反應(yīng)器內(nèi)加入培養(yǎng)液和一種對細(xì)胞無毒害作用的材料支撐的顆粒（微載體） , 使細(xì)胞在微載體表面附著和生長, 并通過不斷攪拌使微載體保持懸浮狀態(tài)。培養(yǎng)液中大量的微載體為細(xì)胞提供了極大的附著表面, 1 g 微載體其比表面積可達(dá)6 000 cm2 , 從而可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的高密度培養(yǎng)。
微載體的直徑在60～250μm , 由天然葡聚糖、凝膠或各種合成的聚合物組成, 如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。由這些材料及其改良型制成的微載體主要參考了細(xì)胞的粘附特性, 在其表面帶有大量電荷及其他生長基質(zhì)物質(zhì), 因而有利于細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖。采用微載體培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn): ①比表面積大, 單位體積培養(yǎng)液的細(xì)胞產(chǎn)率高; ②采用均勻懸浮養(yǎng), 無營養(yǎng)物或產(chǎn)物梯度; ③可用簡單顯微鏡觀察微載體表面的生長情況; ④細(xì)胞收獲過程相對簡單, 勞動強(qiáng)度小; ⑤培養(yǎng)基利用率高, 占地面積小; ⑥放大容易, 國外已有公司以1 000 L 規(guī)模培養(yǎng)人的二倍體細(xì)胞來生產(chǎn)β- 干擾素。但其缺點(diǎn)是攪拌槳及微珠間的碰撞易損傷細(xì)胞; 接種密度高; 微載體吸附力弱, 不適合培養(yǎng)懸浮型細(xì)胞。
1. 1. 3 大孔微載體
人們?yōu)榱私鉀Q微載體培養(yǎng)系統(tǒng)中細(xì)胞易受機(jī)械損傷的缺陷以及能zui大限度地?cái)U(kuò)大比表面積, 開發(fā)了具有*連通溝回的大孔微載體。
大孔微載體將細(xì)胞固定在孔內(nèi)生長, 因而與其他方法相比具有一系列優(yōu)點(diǎn): ①比表面積大,是實(shí)心微載體的幾倍甚至幾十倍; ②細(xì)胞在孔內(nèi)生長, 受到保護(hù), 剪切損傷小; ③與包埋法相比, 傳質(zhì)尤其是傳氧效果好 ; ④兩種類型細(xì)胞都適用;⑤細(xì)胞三維生長, 細(xì)胞密度是實(shí)心微載體的10 倍以上, 有的可達(dá)108 個/ mL; ⑥適用于長期維持培養(yǎng),細(xì)胞生長情況依然良好; ⑦微載體濃度高, 實(shí)心載體在培養(yǎng)液中濃度增大到一定時(shí), 細(xì)胞密度反而下降; 而大孔微載體在濃度較高時(shí), 表面碰撞增加, 能促使細(xì)胞在孔內(nèi)生長; ⑧于蛋白質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言, 大孔微載體質(zhì)生產(chǎn)和產(chǎn)物分泌。因此有人預(yù)言, 大孔微載體技術(shù)將成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一種常用方式。
1. 2 包埋
將動物細(xì)胞包埋在各種多聚物多孔載體中而制成固定化動物細(xì)胞的方法稱為包埋法。此法步驟簡便, 條件溫和, 負(fù)荷量大, 細(xì)胞泄露少。因細(xì)胞嵌入在高聚物網(wǎng)格中而受到保護(hù), 細(xì)胞能抗機(jī)械剪切。但該法也有一定缺點(diǎn), 如擴(kuò)散限制, 并非所有細(xì)胞都處于*營養(yǎng)物濃度。包埋法一般適用于非錨地依賴型細(xì)胞的固定化。多孔凝膠是zui常用的載體, 用于動物細(xì)胞固定化的凝膠主要有海藻酸鈣、瓊脂糖、血纖維蛋白等。
1. 2. 1 海藻酸鈣凝膠
海藻酸鈣凝膠包埋法是將動物細(xì)胞與一定量的海藻酸鈉溶液混合均勻, 然后滴到一定濃度的氯化鈣溶液中形成直徑約1 mm 內(nèi)含動物細(xì)胞的海藻酸鈣膠珠, 分離洗滌后即可用于培養(yǎng)。此法操作時(shí)條件溫和, 對活細(xì)胞損傷小。但固定后機(jī)械強(qiáng)度不高。為了大量制備海藻酸鈣凝膠包埋的固定化細(xì)胞, 國外已有專門的振動噴嘴設(shè)備可供使用。
1. 2. 2 瓊脂糖凝膠
瓊脂糖凝膠可用二相法制得。將含有細(xì)胞的瓊脂糖溶液分散到一個水不溶相中（如石蠟油） , 形成直徑0. 2 mm 凝膠珠珠, 移去石蠟油后, 細(xì)胞即可進(jìn)行培養(yǎng)。同海藻鈣一樣, 瓊脂糖更適于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞。盡管凝膠珠形成過程很復(fù)雜, 目前放大體積不超過20 L 。但瓊脂糖凝膠無毒性, 具有較大的空隙, 可以允許大分子物質(zhì)自由擴(kuò)散, 因此該法特別適用于蛋白產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。有人曾用瓊脂糖包埋雜交瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體和白細(xì)胞介素 。
1. 2. 3 血纖維蛋白
將動物細(xì)胞與血纖維蛋白原混合, 然后加入凝血酶。凝血酶將血纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性的血纖維蛋白, 將動物細(xì)胞固定在其中。血纖維蛋白可以促進(jìn)細(xì)胞貼壁, 因此兩種類型的細(xì)胞都適于培養(yǎng)。而且基質(zhì)高度多孔, 允許大分子物質(zhì)的自由擴(kuò)散。但機(jī)械強(qiáng)度差, 對剪切力很敏感。
1. 3 中空纖維
中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài), 利用一種人工的“毛細(xì)管”即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。典型的封閉中空纖維如下圖：
封閉式中空纖維反應(yīng)器循環(huán)系統(tǒng)示意圖
中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是無剪切、高傳質(zhì)、營養(yǎng)成分的選擇性滲入, 使培養(yǎng)細(xì)胞和產(chǎn)物密度都可達(dá)到比較高的水平。缺點(diǎn)是膜的污染和堵塞, 觀察困難, 細(xì)胞生長或過量氣體產(chǎn)生會破壞纖維。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展趨勢是讓細(xì)胞在管束外空間生長, 以達(dá)到更高的細(xì)胞培養(yǎng)密度。目前中空纖維反應(yīng)器已進(jìn)入工業(yè)化生產(chǎn), 主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞來生產(chǎn)單克隆抗體.
1. 4 微囊化
微囊化培養(yǎng)技術(shù)其要點(diǎn)是: 在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊, 再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。生長介質(zhì)為1. 4 %海藻酸鈉溶液, 半透膜由多聚賴氨酸形成。培養(yǎng)系統(tǒng)可采用攪拌式或氣升式反應(yīng)器系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)證明, 采用批式和連續(xù)灌注式培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體, 在7～27 d微囊內(nèi)抗體濃度可達(dá)1 250～5 300 mg/ L 。利用微囊包裹具有特定功能的組織細(xì)胞, 形成免疫隔離的人工細(xì)胞, 以此植入疾病動物或病人體內(nèi)。1980 年報(bào)道了微囊化胰島移植治療大量實(shí)驗(yàn)性糖尿病。他們將同種大鼠胰島用海藻酸- 聚賴氨酸- 聚乙烯亞胺包埋后植入鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體內(nèi), 在未用免疫抑制劑的情況下, 控制大鼠血糖正常達(dá)一年左右。
膠囊化培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是: ①可防止細(xì)胞在培養(yǎng)過程中受到物理損傷; ②活性蛋白不能從囊中自由出入半透膜, 從而提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物含量, 并方便分離純化處理。缺點(diǎn)是: ①微囊制作復(fù)雜, 成功率不高; ②微囊內(nèi)死亡的細(xì)胞會污染正常產(chǎn)物; ③收集產(chǎn)物必須破壁, 不能實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)連續(xù)化。
2. 固定化方法的選擇
（1） 培養(yǎng)規(guī)模。由于各種固定化系統(tǒng)可以獲得相同的細(xì)胞密度, 且細(xì)胞的產(chǎn)率主要取決于細(xì)胞的擴(kuò)散, 因此反應(yīng)器的體積是培養(yǎng)規(guī)模放大的主要決定因素。雖然微載體系統(tǒng)可以提供zui大的單元操作,但其他系統(tǒng)也可以通過增加單元套數(shù)而獲得放大。
（2） 培養(yǎng)方式。除了海藻酸鈣包埋法外, 其他固定化基質(zhì)都是多孔型的, 能允許大分子物質(zhì)自由出入, 因此可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的連續(xù)生產(chǎn)。在凝膠珠和微囊中可使蛋白產(chǎn)物積聚到很高的濃度, 給后續(xù)的分離純化處理帶來方便, 并大大降低了生產(chǎn)成本。
（3） 所培養(yǎng)的細(xì)胞類型。大多數(shù)固定化系統(tǒng)都適用于貼壁型細(xì)胞的培養(yǎng)。而在吸附非貼壁型細(xì)胞時(shí), 由于吸附力弱容易出現(xiàn)細(xì)胞泄露。
（4） 制備方法的難易和成本。由于固定化基質(zhì)是由制造商在不同的競爭時(shí)期提供的, 因此各種固定化方法的成本很難比較。海藻酸鹽和瓊脂糖是以化學(xué)試劑形式出售; 膠原珠是以無菌形式提供給使用者, 以便于接種。
3. 存在問題
（1） 固定化細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞密度較一般懸浮培養(yǎng)高10～100 倍, 但同時(shí)也帶來了如何保證足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞問題。
（2） 細(xì)胞群體在大規(guī)模、長時(shí)間培養(yǎng)過程中分泌產(chǎn)物能力的丟失或產(chǎn)物活性的降低依然是細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域深感棘手的問題 。包埋在凝膠或微囊中死亡的細(xì)胞會對其他細(xì)胞產(chǎn)生污染和毒害作用。
（3） 培養(yǎng)基及固定化基質(zhì)價(jià)格昂貴, 生產(chǎn)成本高居不下。尤其是的微載體細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì), 銷售價(jià)格一直呈上漲趨勢。
（4） 目前對細(xì)胞代謝和生長動力學(xué)的研究以及在線監(jiān)測水平還遠(yuǎn)不足以設(shè)計(jì)出確定的優(yōu)化培養(yǎng)系統(tǒng), 從而導(dǎo)致昂貴培養(yǎng)基的浪費(fèi)。
4. 固定化動物細(xì)胞培養(yǎng)的展望
固定化動物細(xì)胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是大型化、自動化、精巧化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。從上的發(fā)展趨勢看, 動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要有: （1） 開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器和培養(yǎng)系統(tǒng); （2） 開發(fā)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的載體; （3） 開發(fā)微囊技術(shù); （4） 開發(fā)雜交、重組技術(shù); （5） 開發(fā)無血清和化學(xué)合成的培養(yǎng)基; （6） 蛋白質(zhì)濃縮和提純技術(shù)。
二．動物細(xì)胞的灌注養(yǎng)方法
動物細(xì)胞培養(yǎng)同傳統(tǒng)的微生物細(xì)胞培養(yǎng)相比, 動物細(xì)胞培養(yǎng)存在著細(xì)胞倍增時(shí)間長、代謝途徑復(fù)雜、對營養(yǎng)的要求高、對外界環(huán)境如溫度、pH、溶氧、滲透壓、剪切力的敏感性強(qiáng)、細(xì)胞狀態(tài)容易改變等問題, 大大增加了動物細(xì)胞培養(yǎng)的難度。如何完善細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù), 提高動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的產(chǎn)率, 一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。
1 灌注培養(yǎng)
常用的動物細(xì)胞培養(yǎng)方法有分批培養(yǎng)、補(bǔ)料分批培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng), 但產(chǎn)率一直不高。直到六十年代, 灌注培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn), 為動物細(xì)胞高密度大規(guī)模培養(yǎng)開辟了廣闊的前景。在隨后的三十年中, 灌注培養(yǎng)技術(shù)得到了迅速地發(fā)展, 已成為動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主要方法。
在灌注培養(yǎng)中, 細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中, 收獲培養(yǎng)液的同時(shí)不斷地加入新鮮的培養(yǎng)基。灌注培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是連續(xù)灌注的培養(yǎng)基可以提供充分的營養(yǎng)成分, 并可帶走代謝產(chǎn)物, 同時(shí), 細(xì)胞保留在反應(yīng)器系統(tǒng)中,可以達(dá)到很高的細(xì)胞密度。同其他方法相比,灌注培養(yǎng)的產(chǎn)率可以提高一個數(shù)量級, 并可大大降低勞動力消耗。
灌注培養(yǎng)主要可分為兩大類: 懸浮灌注培養(yǎng)和床層培養(yǎng)（圖1）。懸浮灌注培養(yǎng)是在普通懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上, 加上一個細(xì)胞分離器而成, 以微載體懸浮培養(yǎng)加旋轉(zhuǎn)過濾分離器zui為常見。床層培養(yǎng)則把細(xì)胞直接保留于床層, 不需要細(xì)胞分離器, 其中堆積床和大孔載體培養(yǎng)的應(yīng)用較廣。
2 灌注培養(yǎng)方法
在灌注培養(yǎng)前, 對動物細(xì)胞的生長和生理特性進(jìn)行充分的考察, 是十分必要的, 能為灌注培養(yǎng)提供有益的參考。以比生長速率為例, 大量實(shí)驗(yàn)表明, 細(xì)胞的比生長速率降低時(shí), 產(chǎn)物的比生長速率提高，有人控制細(xì)胞的比生長速率為zui大比生長速率的60%抗體生長速率增加了97%。 灌注培養(yǎng)可以從兩個方面入手, 一是改變動物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境, 實(shí)行階段培養(yǎng); 二是進(jìn)行代謝調(diào)控。
灌注培養(yǎng)分類圖
2. 1 階段培養(yǎng)
一般認(rèn)為, 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實(shí)際上, 每種細(xì)胞的zui適生長條件和zui適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞; 在產(chǎn)物生成期保持細(xì)的高密度, 維持存活率, 降低細(xì)胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢。具體說來, 可以用以下方法。
2. 1 階段培養(yǎng)
一般認(rèn)為, 動物細(xì)胞的培養(yǎng)條件應(yīng)盡量模擬來源動物體內(nèi)的條件, 而且在培養(yǎng)中通常保持不變。而實(shí)際上, 每種細(xì)胞的zui適生長條件和zui適產(chǎn)物生成條件是不同的。階段法培養(yǎng)就是根據(jù)這一點(diǎn), 把培養(yǎng)過程分為細(xì)胞生長期和產(chǎn)物生成期, 分別采取不同的培養(yǎng)條件, 以達(dá)到在細(xì)胞生長期使接種細(xì)胞大量繁殖, 提高比生長速率, 盡快獲得高密度細(xì)胞; 在產(chǎn)物生成期保持細(xì)的高密度, 維持存活率, 降低細(xì)胞死亡速率, 持續(xù)獲得高產(chǎn)率蛋白的目的。當(dāng)產(chǎn)物蛋白對細(xì)胞有抑制時(shí), 階段培養(yǎng)尤見優(yōu)勢。具體說來, 可以用以下方法。
2. 1. 2 pH 值階段培養(yǎng)
對大多數(shù)動物細(xì)胞, 培養(yǎng)液中合適的pH為7. 2—7. 4。低于6. 8 或高于7. 6 對細(xì)胞的生長都不利。近年來, 對胞內(nèi)pH 的研究比較活躍。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) 胞內(nèi)pH 對細(xì)胞的代謝影響很大, 胞內(nèi)pH 降低0. 2 個單位, 就足以使磷酸果糖激酶失活, 抑制糖酵解途徑, 使細(xì)胞的生長受阻; 而胞內(nèi)pH 升高0. 2 個單位,可以提高糖酵解速度50%。胞外pH 的降低和培養(yǎng)液中銨離子濃度的提高, 都能引起胞漿酸化, 胞內(nèi)pH 降低。有人把CO 2 的濃度由5% 降為2. 5% ,胞內(nèi)pH 提高了0. 2 個單位。胞內(nèi)pH 比胞外pH 的檢測麻煩 , 所以還沒有廣泛應(yīng)用。
2. 1. 3 溶氧階段培養(yǎng)
不同細(xì)胞和同一細(xì)胞在不同生長時(shí)期對氧的需求均不相同.有人 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長的zui適溶氧值為60% , 但有人發(fā)現(xiàn)雜交瘤的zui適溶氧為100%。一般說來, 溶氧主要影響細(xì)胞的繁殖, 而對產(chǎn)物的生成無直接影響, 通過影響細(xì)胞生長間接起作用。通常在細(xì)胞生長初期控制溶氧的較低的水平, 在對數(shù)生長期, 當(dāng)細(xì)胞達(dá)到較高的濃度時(shí), 提高溶氧水平; 在產(chǎn)物生成期, 應(yīng)控制溶氧的適當(dāng)水平。溶氧過高, 細(xì)胞就會加速消耗營養(yǎng)物質(zhì), 產(chǎn)生許多代謝產(chǎn)物。這些代謝產(chǎn)物對細(xì)胞有抑制作用, 會大大降低細(xì)胞的存活率, 降低產(chǎn)物的比生成速率。溶氧過低, 細(xì)胞過氧的需求得不到滿足, 依然會降低產(chǎn)物蛋白的產(chǎn)率。
2. 1. 4 化學(xué)試劑誘導(dǎo)階段培養(yǎng)
如果構(gòu)建的細(xì)胞上有可誘導(dǎo)基因, 進(jìn)入產(chǎn)物生成期后, 就可以添加化學(xué)試劑對基因進(jìn)行誘導(dǎo), 以實(shí)現(xiàn)目的基因的高表達(dá), 比如,將表達(dá)尿激酶原和二氫葉酸還原酶基因的兩個轉(zhuǎn)錄單位置于同一載體, 分別受金屬硫（M T ） 和SV 40 早期啟動子控制, 具有用氨甲喋呤（M TX） 使基因擴(kuò)增和利用金屬Zn2+ 誘導(dǎo)的雙重功能, 有利于尿激酶的高表達(dá)。
細(xì)胞在細(xì)胞周期的不同時(shí)期, 不僅蛋白的分泌速率不同, 而且所分泌蛋白的類型和糖基化程度也可能不同。因此, 研究并控制細(xì)胞的生理狀態(tài)很重要。然而, 在細(xì)胞培養(yǎng)中, 細(xì)胞生理狀態(tài)的檢測很麻煩。有人發(fā)現(xiàn),細(xì)胞大小隨各時(shí)期變化很明顯, 因此可以作電子細(xì)胞計(jì)數(shù)器就行了。分段培養(yǎng)應(yīng)結(jié)合具體的培養(yǎng)條件進(jìn)行。有些細(xì)胞的zui適生長溫度和產(chǎn)物生成溫度相同, 就不能進(jìn)行溫度階段培養(yǎng), 而應(yīng)尋找別的差異條件。在細(xì)胞生長期有的細(xì)胞可能會因比生長速率過大而產(chǎn)生非生產(chǎn)性細(xì)胞, 這時(shí)就應(yīng)控制比生長速率在一個適當(dāng)?shù)姆秶?/p>
3 代謝調(diào)控培養(yǎng)
乳酸和氨是在培養(yǎng)過程中動物細(xì)胞產(chǎn)生的主要代謝產(chǎn)物 , 對細(xì)胞的正常生理功能在抑制甚至毒害作用。在分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中的這一問題尤為突出。盡管灌注培養(yǎng)可以通過提高灌注速度來去除抑制產(chǎn)物。但是, 一方面由于灌注培養(yǎng)細(xì)胞濃度很高, 提高灌注速率, 營養(yǎng)成分的供給十分充分, 氨和乳酸的產(chǎn)生速率也增加了。另一方面, 過高的灌注速率提高了細(xì)胞的比生長速率, 降低產(chǎn)物的比產(chǎn)率, 加上細(xì)胞對營養(yǎng)的利用并不*, 培養(yǎng)液中會殘留大量的蛋白, 造成提取純化的不便和培養(yǎng)基的浪費(fèi)。所以, 在培養(yǎng)中調(diào)控動物細(xì)胞的代謝途徑一直較受重視。通過代謝調(diào)控, 可以減少副產(chǎn)物的產(chǎn)生, 降低細(xì)胞的死亡速率, 還可以控制灌注速率和培養(yǎng)液成分, 控制細(xì)胞的狀態(tài)和比生長速率, 以提高目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。具體有以下方法。
3. 1 控制葡萄糖濃度法
乳酸濃度升高,會導(dǎo)致比生長速率降低, 比死亡速率升高。乳酸的降低可更換葡萄糖為己糖如果糖或半乳糖 , 還可限制葡萄糖減少乳酸的生成, 使初始葡萄糖濃度較低, 在培養(yǎng)過程中再添加。在控制葡萄糖濃度法培養(yǎng)中, 生長期可以使葡萄糖濃度稍高, 以促進(jìn)細(xì)胞生長; 在產(chǎn)物合成期降低葡萄糖的濃度, 降低乳酸的產(chǎn)生速率, 避免乳酸的積累, 減少毒害, 降低死亡速率, 維護(hù)持活細(xì)胞數(shù)在較高水平。同時(shí)還可以降低比生長速率, 增加目標(biāo)蛋白的產(chǎn)生速率。
灌注葡萄糖的同時(shí), 要間歇或連續(xù)地加入其他組分, 以避免營養(yǎng)缺乏, 其中谷氨酰胺要保持在較低水平, 因?yàn)榧?xì)胞的生長不依賴糖酵解 , 即使沒有葡萄糖, 細(xì)胞仍可以通過降解谷氨酰胺獲得能量。假如谷氨酰胺的濃度過高, 細(xì)胞就會偏向谷氨酰胺酵解, 從而削弱這種方法的效果。由于葡萄糖的價(jià)格相對低廉, 這種方法很有前途。
3. 2 控制谷氨酰胺法
上面提到, 沒有葡萄糖, 細(xì)胞可以利用谷氨酰胺作能量物質(zhì)。因此, 控制谷氨酰胺比控制葡萄糖要容易些, 應(yīng)用這一方法的報(bào)道也較多?？刂乒劝滨０窛舛鹊哪康? 主要是減少氨的產(chǎn)生。氨對細(xì)胞的毒性比乳酸大得多, 表現(xiàn)為降低比生長速率, 增加死亡速率。有人詳細(xì)地研究了動物細(xì)胞的代謝過程, 采用底物限制補(bǔ)料分批工藝對動物細(xì)胞進(jìn)行代謝控制。他采用這一方法, 使氨的濃度降低了一半。控制谷氨酰胺法與控制葡萄糖法一樣, 要維持葡萄糖在較低水平。
3. 3 控制葡萄糖和谷氨酰胺法
在細(xì)胞中, 葡萄糖代謝和谷氨酰胺代謝密切相關(guān)。葡萄糖消耗上升, 則谷氨酰胺消耗下降, 反之亦然。在相當(dāng)大的一個范圍內(nèi), 葡萄糖和谷氨酰胺的消耗速率與其濃度成正比。控制葡萄糖和谷氨酰胺法可降低乳酸和氨的產(chǎn)生, 還能有效控制比生長速率。在細(xì)胞生長期, 提供充分的營養(yǎng), 供細(xì)胞的需要; 在產(chǎn)物合成期, 降低葡萄糖和谷氨酰胺的濃度或流量, 降低比生長速率, 增加目標(biāo)蛋白的產(chǎn)率。
3. 4 代謝產(chǎn)物的去除
通常使用透析膜, 超濾臘或吸附劑選擇性去除乳酸、氨或銨離子。有人建議加化學(xué)試劑比如鉀鹽來消除氨的影響 , 也有人建議可使用有谷氨酰胺合成酶的細(xì)胞。
灌注培養(yǎng)發(fā)展到現(xiàn)在, 還有許多急待解決的問題。其zui大的缺點(diǎn)是培養(yǎng)基的利用不充分, 造成一定的浪費(fèi)。隨著細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和產(chǎn)品分離技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展, 建立細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)（圖2） , 能充分利用培養(yǎng)液, 降低生產(chǎn)成本, 一直是人們追求的目標(biāo), 這里就不贅述。
細(xì)胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)圖
三 . 動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)技術(shù)
動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的重要研究課題之一。由于無血清培養(yǎng)基可以是*采用已知分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型組分的低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基。因而它不僅為研究和闡明細(xì)胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)機(jī)制提供了有力的工具，而且為現(xiàn)代生物技術(shù)，尤其是細(xì)胞工程的應(yīng)用準(zhǔn)備了更好的條件。下面就動物細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其應(yīng)用現(xiàn)狀做一概述。
1 動物細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展過程：
（1）天然培養(yǎng)基階段
（2）合成培養(yǎng)基階段
（3）無血清培養(yǎng)階段
2 動物細(xì)胞培養(yǎng)中血清的作用和可能引發(fā)的問題
作用：
（1）提供有利于細(xì)胞生長增殖所需的激素、生長因子或提供合成培養(yǎng)基所缺乏的營養(yǎng)物質(zhì)。（2）提供可識別金屬、激素、維生素和脂質(zhì)的結(jié)合蛋白，并通過與上述物質(zhì)的結(jié)合而起到穩(wěn)定和調(diào)節(jié)上述物質(zhì)的作用。此外結(jié)合蛋白還可消除某些毒素和金屬對細(xì)胞的毒性作用。（3）提供貼壁細(xì)胞固著于適當(dāng)?shù)母街嫠璧馁N壁因子和擴(kuò)展因子。（4）提供蛋白酶抑制劑，使細(xì)胞免受蛋白酶的損傷。（5）提供 PH 緩沖物質(zhì)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基PH。（6）影響培養(yǎng)系統(tǒng)中的某些物理特性如：剪切力、黏度、滲透壓和氣體傳遞速度等。
可能引發(fā)的問題：
（1）在一些基礎(chǔ)研究中，往往影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
（2）血清中含有某些不利于細(xì)胞生長的毒性物質(zhì)或抑制 物質(zhì)，對某些細(xì)胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。
（3）血清中大量成分復(fù)雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細(xì)胞因子、單克隆抗體等細(xì)胞產(chǎn)品的分離純化帶來很大困難。
3 無血清培養(yǎng)基的組成及其主要補(bǔ)充成分
（1）激素和生長因子
（2）結(jié)合蛋白
（3）貼壁因子和擴(kuò)展因子
（4）低分子量營養(yǎng)因子
4 .無血清培養(yǎng)基的優(yōu)缺點(diǎn)及其應(yīng)用
優(yōu)點(diǎn)：
（1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。
（2）避免血清對細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。
（3）避免血清組分對實(shí)驗(yàn)研究的影響。
（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。
（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。
已應(yīng)用的領(lǐng)域有：
（1）研究細(xì)胞的分化條件
（2）用于激素、生長因子和藥物等與細(xì)胞相互作用的研究
（3）用于從多種細(xì)胞混雜的培養(yǎng)基中選擇目的細(xì)胞
（4）腫瘤病理學(xué)和病因?qū)W的研究
（5）用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品
缺點(diǎn)：組要表現(xiàn)為細(xì)胞的適用范圍窄，細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。
四. 動物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器
細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器是整個過程的關(guān)鍵設(shè)備,它要為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境并決定著細(xì)胞培養(yǎng)的質(zhì)量和產(chǎn)量。按照動物細(xì)胞的生長要求, 具備低的剪切效應(yīng)、較好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)是這類反應(yīng)器設(shè)計(jì)或改進(jìn)所必須遵循的原則。
1 攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式反應(yīng)器靠攪拌槳提供液相攪拌的動力,它有較大的操作范圍、良好的混合性和濃度均勻性, 因此在生物反應(yīng)中被廣泛使用。但由于動物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁的保護(hù), 因此對剪切作用十分敏感,直接的機(jī)械攪拌很容易對其造成損害, 傳統(tǒng)的用于微生物的攪拌反應(yīng)器用作動物細(xì)胞的培養(yǎng)顯然是不合適的。所以, 動物細(xì)胞培養(yǎng)中的攪拌式反應(yīng)器都是經(jīng)過改進(jìn)的, 包括改進(jìn)供氧方式、攪拌槳的形式及在反應(yīng)器內(nèi)加裝輔件等。
1. 1 供氧方式的改進(jìn)
一般情況下, 攪拌式反應(yīng)器還常伴有鼓泡, 為細(xì)胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪胞生長提供所需氧分。由于動物細(xì)胞對鼓泡的剪切也很敏感, 所以人們在供氧方式的改進(jìn)上做了許多工作。
籠式供氧是攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器供氧方式的一種, 即氣泡用絲網(wǎng)隔開, 不與細(xì)胞直接接觸。反應(yīng)器既能保證混合效果又有盡可能小的剪切力, 以滿足細(xì)胞生長的要求。北野昭一報(bào)道了一個經(jīng)過改進(jìn)的攪拌式動物細(xì)胞反應(yīng)器, 整體呈梨形, 攪拌置于反應(yīng)器底部, 在攪拌軸外裝了一個錐形不銹鋼絲網(wǎng)與攪拌軸一起轉(zhuǎn)動。軸心處的鼓泡管在絲網(wǎng)內(nèi)側(cè)鼓泡, 絲網(wǎng)外側(cè)的細(xì)胞不與氣泡直接接觸。
1. 2 攪拌槳的改進(jìn)
攪拌槳的形式對細(xì)胞生長的影響非常大, 這方面的改進(jìn)主要考慮如何減小細(xì)胞所受的剪切力。有人對攪拌槳的形式作了改進(jìn), 并在反應(yīng)器內(nèi)加裝了輔件, 實(shí)驗(yàn)證明改進(jìn)后的反應(yīng)器適用于對剪切力敏感的細(xì)胞進(jìn)行高密度培養(yǎng)。反應(yīng)器采用了一個雙螺旋帶狀攪拌槳, 頂部的法蘭蓋上安裝了3 塊表面擋板。每塊擋板相對于徑向的夾角為30°, 垂直插入液面。擋板的存在減小了液面上的旋渦。這個反應(yīng)器維持了較小的剪切力, 實(shí)驗(yàn)中用于昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng), zui終的培養(yǎng)密度達(dá)到6 ×106 個/ mL , 成活率在98 %以上。
2 非攪拌式生物反應(yīng)器
攪拌式生物反應(yīng)器用于動物細(xì)胞培養(yǎng)存在的zui大缺點(diǎn)是剪切力大, 容易損傷細(xì)胞, 雖然經(jīng)過各種改進(jìn), 這個問題仍很難避免。相比之下, 非攪拌式反應(yīng)器產(chǎn)生的剪切力較小, 在動物細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了較強(qiáng)的優(yōu)勢。
2. 1 填充床反應(yīng)器
填充是在反應(yīng)器中填充一定材質(zhì)的填充物, 供細(xì)胞貼壁生長。營養(yǎng)液通過循環(huán)灌流的方式提供, 并可在循環(huán)過程中不斷補(bǔ)充。細(xì)胞生長所需的氧分也可以在反應(yīng)器外通過循環(huán)的營養(yǎng)液攜帶, 因而不會有氣泡傷及細(xì)胞。這類反應(yīng)器剪切力小, 適合細(xì)胞高密度生長。
Park 等人在由填充床反應(yīng)器和外循環(huán)裝置構(gòu)成的連續(xù)流動的培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)動物細(xì)胞。反應(yīng)器中的填料是帶有微孔的陶瓷珠粒, 細(xì)胞在微孔內(nèi)生長, 同時(shí)培養(yǎng)液也可以在孔內(nèi)擴(kuò)散。實(shí)驗(yàn)證明該反應(yīng)器適于動物細(xì)胞的高密度培養(yǎng), 細(xì)胞終期密度應(yīng)器適于動物細(xì)胞的高密度培養(yǎng), 細(xì)胞終期密度達(dá)到了5 ×108 個/ mL 。
2. 2 中空纖維反應(yīng)器
中空纖維反應(yīng)器 由于剪切力小而廣泛用于動物細(xì)胞的培養(yǎng)。這類反應(yīng)器由中空纖維管組成, 每根中空纖維管的內(nèi)徑約為200μm , 壁厚為50～70μm。管壁是多孔膜, O2和CO2 等小分子可以自由透過膜擴(kuò)散, 動物細(xì)胞貼附在中空纖維管外壁生長, 可以很方便地獲取氧分 。
John 等報(bào)道了一個用于大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞的徑向流中空纖維反應(yīng)器。該反應(yīng)器內(nèi)有一個垂直的中央分配管, 外面由中空纖維管與分配管呈平行組成一個環(huán)狀床層。培養(yǎng)液由中央分配管徑向流過中空纖維床, 細(xì)胞在中空纖維外壁貼附并生長?？諝夂虲O2 的混合氣體在中空纖維間與培養(yǎng)液成錯流流過床層, 向細(xì)胞提供氧分并維持一定的pH值環(huán)境, 細(xì)胞的代射物隨氣流帶出。在這個反應(yīng)器中細(xì)胞生長的表面密度可達(dá)7. 3 ×106 個/ cm2 。
2. 3 氣升式生物反應(yīng)器
氣升式生物反應(yīng)器（airlift bioreactor） 也是實(shí)現(xiàn)動物細(xì)胞高密度培養(yǎng)的常用設(shè)備之一, 其特點(diǎn)是結(jié)構(gòu)簡單, 操作方便。
有人在氣升式反應(yīng)器中利用微載體培養(yǎng)技術(shù), 研究了Vero 細(xì)胞高密度培養(yǎng)的工藝條件。證明氣升式反應(yīng)器中懸浮微載體培養(yǎng)Vero 細(xì)胞, 在加入適量保護(hù)劑、營養(yǎng)供應(yīng)充足的情況下,細(xì)胞可以正常生長至長滿微載體表面, 終密度可達(dá)1. 13 ×106 個/ mL 。
4 結(jié) 語
動物細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器,主要解決的共性問題都是要按照動物細(xì)胞的生長要求, 使反應(yīng)器具備低的剪切效應(yīng)、良好的傳遞效果和流體力學(xué)性質(zhì)。但在實(shí)際過程中, 這些原則總有一些相互制約的因素, 為了強(qiáng)化傳遞效果需要有一個充分的混合環(huán)境（包括氣體鼓泡） , 但動物細(xì)胞的脆弱性制約了這個環(huán)境的形成;為提高培養(yǎng)介質(zhì)中的溶氧度需要有較高的氧分壓,不過, 高的氧分壓也影響了代謝物的移出。同時(shí),過高的氧分壓也影響細(xì)胞的正常生長。如何優(yōu)化這些制約, 是這類反應(yīng)器開發(fā)中要解決的問題。在動物細(xì)胞培養(yǎng)中, 反應(yīng)器的改進(jìn)大多針對攪拌式反應(yīng)器。雖然這類反應(yīng)器剪切力大, 但由于它混合均勻、結(jié)構(gòu)簡單、操作方便以及良好的傳遞效果和操作彈性, 在大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)中仍占有重要的位置 。
目前, 研究工作要致力于開發(fā)高密度細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器, 提高細(xì)胞生產(chǎn)率或生物產(chǎn)物的濃度。尤其組織工程的迅速發(fā)展, 對動物細(xì)胞生物反應(yīng)器有了不同要求。要保持細(xì)胞離體培養(yǎng)時(shí)能具有同體內(nèi)一樣的三維異性結(jié)構(gòu)、維持分化細(xì)胞的功能并支持細(xì)胞的高密度生長 , 培養(yǎng)過程要考慮種植有細(xì)胞的三維基質(zhì)支架和生物反應(yīng)器所組成的培養(yǎng)系統(tǒng)。事實(shí)上, 一種反應(yīng)器的開發(fā)不可能滿足動物細(xì)胞生長的所有要求, 同時(shí)也不可能適合所有的細(xì)胞培養(yǎng)方式。所以, 根據(jù)某種細(xì)胞的培養(yǎng)過程或細(xì)胞的某種培養(yǎng)方式, 開發(fā)反應(yīng)器也許會比通用反應(yīng)器有更好的效果。
五 其它方法：改變細(xì)胞特性
在大規(guī)模動物細(xì)胞培養(yǎng)的初期, 細(xì)胞數(shù)量不斷增加, 表達(dá)重組蛋白的能力也在逐步提高L細(xì)胞表達(dá)隨細(xì)胞數(shù)量達(dá)到之后, 細(xì)胞數(shù)量和表達(dá)水平將下降L 因?yàn)橛糜谏a(chǎn)具有重要醫(yī)用作用的生物活性蛋白的工程細(xì)胞, 其基因組普遍整合了病毒載體, 這就從根本上決定了細(xì)胞zui終命運(yùn)是細(xì)胞凋亡L 目前已知參與細(xì)胞凋亡調(diào)控基因包括c2m yc、c2jun、bcl22、c2fo s、ras、p 53、bcl2x、bax 等,有些促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 有些抑制細(xì)胞凋亡L將抑制細(xì)胞凋亡的bcl22 基因?qū)爰?xì)胞, bcl22 基因的過量表達(dá)可抑制Gln 或缺氧引起的細(xì)胞凋亡, 減少細(xì)胞特定營養(yǎng)成分的消耗, 提高細(xì)胞密度和目的蛋白產(chǎn)量L已證實(shí)bcl22 基因的過度表達(dá)可以提高灌流培養(yǎng)中雜交瘤細(xì)胞的活性和抗體的生產(chǎn)率.
六 結(jié) 語
一項(xiàng)新的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展成熟需要較長的時(shí)間。大規(guī)模培養(yǎng)動物細(xì)胞是一項(xiàng)復(fù)雜而且經(jīng)驗(yàn)性很強(qiáng)的工作L嚴(yán)格控制細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境, 防止污染, 是進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)的前提L通過減少培養(yǎng)基中各種不利因素, 配置細(xì)胞生長的專一性無血清培養(yǎng)基, 以及選擇條件溫和、易操作、氣體交換速度快的生物反應(yīng)器和細(xì)胞生長的微載體,可提高細(xì)胞的活性和表達(dá)水平。
